CY5-色氨酸，Cy5-Tryptophan用于药物活性分子递送追踪

“CY5-色氨酸”（Cy5-Tryptophan）是一种将 近红外荧光染料 Cy5 与天然芳香族氨基酸 色氨酸（Tryptophan） 共价偶联而成的 荧光标记探针。它主要用于生物成像、细胞摄取研究、药物递送追踪以及作为分子工具探索色氨酸代谢或转运机制。

一、基本成分解析

1. 色氨酸（Tryptophan）

中文名：色氨酸

英文名：L-Tryptophan（通常指生物活性 L-构型）

化学名称：(2S)-2-Amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid

分子式：C₁₁H₁₂N₂O₂

分子量：204.23 g/mol

结构特征：含 吲哚环（大共轭芳香体系），是20种标准氨基酸中最大且最疏水的一种。

生理/生物学作用：

蛋白质合成必需氨基酸：参与几乎所有蛋白质的构建。

神经递质前体：

→ 5-羟色胺（血清素，Serotonin）：调节情绪、睡眠、食欲；

→ 褪黑素（Melatonin）：调控昼夜节律。

免疫调节：通过 犬尿氨酸通路（Kynurenine pathway） 代谢，影响 T 细胞功能，在肿瘤免疫逃逸中起关键作用。

内源性荧光：色氨酸本身在 ~280 nm 激发下有紫外荧光，常用于蛋白折叠/构象研究。

氨基酸转运体底物：可通过 LAT1（L-type amino acid transporter 1）等进入细胞，在多种肿瘤中高表达，因此具有潜在靶向价值。

2. Cy5（Cyanine 5）

激发/发射波长：约 650/670 nm

特点：红光至近红外区荧光，适用于共聚焦显微镜、流式细胞术、活体小动物成像。

常见活性形式：Cy5-NHS 酯、Cy5-maleimide、Cy5-azide 等，便于与氨基、巯基或通过点击化学偶联。

二、“Cy5-色氨酸”的构建方式

由于色氨酸含有一个 α-氨基 和一个 羧基，通常选择 α-氨基 作为偶联位点，避免破坏其关键的吲哚环结构。

标准合成策略（以 Cy5-NHS 为例）：

反应原理：
Cy5-NHS 酯在弱碱性条件下（pH 8.0–8.5）与色氨酸的 α-氨基发生亲核酰化反应，形成稳定的 酰胺键：

Cy5–NHS + H₂N–CH(COOH)–CH₂–Indole  → Cy5–CO–NH–CH(COOH)–CH₂–Indole + NHS

反应条件：

溶剂：PBS 缓冲液、碳酸氢钠缓冲液，或 DMF/水混合体系（提高 Cy5 溶解度）

温度：室温或 4°C（避光）

时间：1–4 小时

摩尔比：Cy5-NHS : 色氨酸 ≈ 1.2 : 1（避免过度标记）

纯化：

反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离未反应的 Cy5 和产物

冻干得纯品，通过 质谱（MS） 验证分子量（理论 [M+H]⁺ ≈ 204 + 767 − 18 ≈ 953 Da，具体取决于 Cy5 衍生物）

三、实验应用与功能

1. 氨基酸转运研究

利用肿瘤细胞高表达 LAT1 转运体 的特性，Cy5-色氨酸可用于：

实时观察色氨酸类似物的 细胞摄取动力学

筛选 LAT1 抑制剂（如 JPH203）

评估药物竞争性摄取

2. 肿瘤靶向成像探针

因许多肿瘤（如胶质瘤、肺癌、乳腺癌）依赖色氨酸代谢，Cy5-色氨酸可作为 代谢导向型荧光探针，实现肿瘤组织富集成像。

3. 犬尿氨酸通路研究工具

虽然偶联后色氨酸通常无法被 IDO/TDO 酶代谢（因 α-氨基被封闭），但可用于：

对照实验（验证代谢依赖性）

构建不可代谢的荧光类似物，研究转运 vs 代谢贡献

4. 纳米载体功能化验证

将色氨酸修饰到脂质体或聚合物表面可增强肿瘤靶向性；Cy5-色氨酸可作为模型分子验证此类系统的递送效率。

5. 荧光共振能量转移（FRET）供体/受体

色氨酸自身为紫外荧光团（供体），Cy5 为红光受体，理论上可构建 intramolecular FRET system，用于构象传感（但实际因距离限制较少用）。